产品货号:
WH0098
中文名称:
cDNA第一链快速合成试剂盒(去除gDNA)
英文名称:
QuickQuant RT Kit(with gDNase)
产品规格:
25次|100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒是一种高效、快速并可以完全去除gDNA污染的反转录系统。本试剂盒所含的高效反转录酶QuickQuant RT Enzyme,42℃,15min即可完成cDNA第一链的合成,并具有与RNA模板高亲合性的特点,能通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板。另外,本试剂盒含有高效去除gDNA的全新gDNase,42℃,3min即可完全去除gDNA,有效避免Total RNA中gDNA的干扰,使qPCR结果更加准确可靠。
- 快速:3min完全去除gDNA。
- 高效:15min反转录效率高达90%。
- 简单:仅需2步主要操作。
- 强力:42℃轻松通读高GC和复杂模板。
特别适合荧光定量RT-PCR检测;RT-PCR;cDNA文库构建;SAGE(基因表达连续分析);引物延伸。
组分 | 20μL×25次 | 20μL×100次 |
5×gDNA Buffer | 50μL | 200μL |
QQ-RT Primer Mix | 50μL | 200μL |
RT Enzyme Mix | 25μL | 100μL |
10×Fast RT Buffer | 50μL | 200μL |
RNase- Free ddH2O | 1mL | 2×1mL |
保存:-20℃,有效期一年。
- 下列操作步骤适用于模板量为50ng~2μg的总RNA,如果总RNA量大于2μg,请按比例扩大反应体系。
- 在冰上进行操作,防止RNA发生降解。
- 不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板,推荐使用变性步骤,即在操作步骤之前,将模板RNA在65℃孵育5min后迅速转移到冰上,进行下一步操作。
- 根据实验需求不同,也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer,引物使用量如下:Oligo-dT Primer 50pmol/20μL反应体系,Gene Specific Primer 5pmol/20μL反应体系。
- 使用Gene Specific Primer时,反转录反应可设置为42℃,15min。当PCR反应有非特异性扩增时,将反转录温度升到50℃会有改善。
- 反转录体系可以根据需要相应扩大。
50ng~2μg总RNA可建立20μL反应体系。
- 将模板RNA在冰上解冻;5×gDNA Buffer、QQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温(15~25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先配制成Mix,然后再分装到每个反应管中。 - 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液,彻底混匀。简短离心,并置于42℃,孵育3min。然后置于冰上放置。
表1:gDNA去除反应体系加入物 使用量 5×gDNA Buffer 2μL Total RNA RNase-Free ddH2O 补足到10μL - 按照表2的反转录反应体系配制混合液。
表2:反转录反应体系加入物 使用量 10×Fast RT Buffer 2μL RT Enzyme Mix 1μL QQ-RT Primer Mix 2μL RNase-Free ddH2O 补足到10μL - 将反转录反应中的Mix,加到gDNA去除步骤的反应液中,充分混匀。
- 42℃,孵育15min。
- 95℃,孵育3min之后放于冰上,得到的cDNA可用于后续实验,或低温保存。
注:- 若后续实验为实时荧光定量PCR,逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10,例如50μL的PCR反应体系,逆转录产物的加量应不超过5μL。
- 将逆转录产物置于冰上,再进行后续PCR反应;如果需要长时间保存,请置于-20℃。
- 若后续实验为实时荧光定量PCR,逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10,例如50μL的PCR反应体系,逆转录产物的加量应不超过5μL。
对RNA模板的要求:
逆转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA,模板RNA的质量和数量直接影响逆转录的结果。
- 模板的完整性:模板RNA的完整性对逆转录非常重要,若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA,最后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。
- 模板的纯度:若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质,将影响逆转录酶的活性,最后影响逆转录结果。
- 模板的加量:上述操作步骤适用于模板RNA量为50ng~2μg,如果模板RNA的量大于2μg,请按比例扩大反应体系。
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